战争爆发8年之后，凯瑟琳·德·美第奇为了巩固两派之间已经达成的协议，提议将查理九世的妹妹玛格丽特公主嫁给年轻的纳瓦拉国王波旁王朝的亨利。这场联姻让天主教派和新教派都同样欢欣鼓舞，两个教派的领袖们齐聚巴黎，出席两个人的婚礼。
婚礼仪式后的欢宴还没开始，世界就被有史以来最可怕的罪行所震惊——在圣巴托洛缪节那天对胡格诺派的大屠杀。导致这场可怕悲剧的有如下背景：参加这场婚礼的新教贵族中有科利尼上将。因为嫉妒科利尼上将超过了自己儿子的影响力，凯瑟琳决定处死科利尼上将。刺杀没有成功，科利尼上将躲过了刺客致命的子弹，只受了一点轻伤。胡格诺派教徒聚集在受伤的首领身旁，威胁着要报复。凯瑟琳被一种极度疯狂的恐惧所驱使，决定把杀光巴黎的所有胡格诺派教徒作为确保安全的唯一手段。8月23日这天，屠杀的计划都安排好了。当晚，凯瑟琳去找自己的儿子，告诉他胡格诺派教徒正密谋要刺杀王室成员和天主教的首领，只有立即消灭巴黎城内的所有新教徒才能避免自己的家族被彻底毁灭。屠杀的命令放到国王的面前，等待他来签字。年轻的国王在这个行动面前恐惧地退缩了，一开始，他拒绝在命令上签字；但最终被他的母亲所说服，他大喊：“我可以批准行动，但前提是，法国境内的胡格诺派教徒不能留一个活口，以免他们以后向我复仇。”
圣巴托洛缪节（1572年8月24日）的午夜刚过，约定的信号一发出——敲钟——大屠杀便开始了。科利尼上将是最早的遇害者之一。屠杀行动持续了三天三夜。巴黎的受害人数估计在1000至10000人之间。巴黎市内的胡格诺派教徒清洗完毕后，王室下令法国的主要城市都要对异端分子实施同样的行动。很多地方拒绝执行命令；但是大部分地方还是执行了命令，法国境内可怕的大屠杀开始了。全国的死亡人数并不确定；估计的数字也大相径庭，从2000人到10万人不等。
圣巴托洛缪大屠杀引发了整个文明世界——无论是天主教，还是新教——的一片咒骂之声。但是，据说腓力二世得到这样的消息却难掩喜悦之情；教皇格里高利十三世教皇举行庆祝弥撒来纪念这一事件，在罗马的圣马可大教堂进行唱诗活动。关于这一说法，天主教作家认为教皇有如此举动是因为接到了错误信息，说是胡格诺派教徒对法国王室和天主教发动政变受阻才导致了大屠杀。
