伊丽莎白统治时期的大部分时间都和她的表妹苏格兰女王玛丽·斯图亚特（Mary Stuart）交织在一起。玛丽素有“近代海伦”（Modern Helen）之称，又被称作是“这个世界上最美丽最虚弱最有魅力又最禁不住诱惑的女子”。她是苏格兰国王詹姆斯五世的女儿，一出生就在英国王位的继承权上排在了玛丽·都铎（Mary Tudor）之后，因为所有天主教教徒都不承认亨利八世和安妮·博林的婚姻。
1560年，玛丽的丈夫——法国的弗朗索瓦二世（Francis II）去世后，玛丽放弃了自己法国宫廷的生活，回到了苏格兰。当时她只有19岁，她的魅力似乎吸引了除狂热的改革者外所有见到她的人，改革者永远不会忘记他们年轻的君主是一个天主教徒。严厉的老约翰·诺克斯（John Knox）使得玛丽的一生痛苦不堪，他称玛丽为“摩押人”（Moabite）——摩押是罗得跟大女儿乱伦所生的儿子，其后代便被成为摩押人——和其他难听的名字。
还有其他事情让玛丽无法获得人民的爱戴。她的第二任丈夫达恩利勋爵（Lord Darnley）被人暗杀。有人怀疑玛丽与此事有关系。她被投入监狱，被迫让位给襁褓中的儿子詹姆斯。
从监狱逃脱后，玛丽逃往英格兰（1568）。在这里，她的表姐伊丽莎白对玛丽盛情款待并尽力帮助她重回王位。但是传言中的参与暗杀自己的丈夫，对英国王位的觊觎，还有她是天主教徒的事实，都决定了她的命运多舛。她受到了监禁，在监牢里度过了19年。在此期间，玛丽是所有天主教阴谋的中心，目的就是让她重新获得王位。教皇庇护五世（Pius V）为此颁布诏令，将伊丽莎白逐出教会，并给全部臣民以信仰自由（1570）。最终，一个精心策划的刺杀伊丽莎白扶正玛丽的阴谋诞生。西班牙国王腓力二世也牵涉进来，他写道：“这个事件是向上帝尽职，因此必须全力支持。我们希望上帝会为此开心，即使为此付出罪恶的代价。”
玛丽因共谋而接受审判，并被判有罪。几经犹豫之后——不管是不是假装，伊丽莎白下令将玛丽处死（1587）。即使伊丽莎白签署了执行死刑的命令，她仍然试图为此逃避责任，建议玛丽的看守能够秘密将她杀死。
