数学尽管如此神妙，仍不过是一种计量的工具，它并未声称它可以了解或描述实体。牛顿从工具转而追求本质时，他首先注意到光的秘密。最初，他在剑桥大学的课程是光、颜色和视觉。一如其习惯，他等到35年后的1704年，才出版他的《光学》一书。对出版，他总是不急。1666年，他在斯陶尔布里奇展会（Stourbridge Fair）上买得一个三棱镜，从而开始光学实验。从1668年开始，他制造了一连串的望远镜。为求避免折射望远镜固有的某些缺点，他根据梅森（1639年）和詹姆士·格列高利（1662年）的理论，自制了一个反射望远镜，并于1671年应皇家学会之请，将其呈送给该会。1672年1月11日，他被选为学会的会员。
在制造望远镜之前（1666年），他已完成他的基本发现之一，即白色光或阳光并非是单纯、均匀的，而是红、橘红、黄、绿、蓝、紫、靛蓝等颜色的复合体。他使一小束阳光穿过透明三棱镜时，他发现看似单色的光线分成了虹的颜色，每一种颜色成分依其本身特有的角度或折射度出现，颜色自成一排光带，形成连续光谱，红、紫各在一端。后来的研究显示，各种物质经过燃烧发光后，会产生不同的光谱。将这些光谱与某一星球的光谱比较，就可能对该星球的化学成分做某种程度的分析。对星球光谱做进一步的细微观察，可显示其朝向地球或离开地球运动的近似速率，经过这些计算，星球的距离便可导出。因此，牛顿的光组合及光谱中折射性质的发现，对天文学产生了广泛的影响。
他几乎未预料到这些结果，只是觉得（如他给奥尔登堡的信中所说的）自己“要不是得到自然运作中最可注意的发现，就是得到最奇怪的发现”。牛顿于1672年把一篇题为《关于光和颜色的新理论》（“New Theory about Light and Colors”）的文章送到皇家学会。该文于2月8日宣读给会员们听，激起了一场越过海峡直抵欧陆的辩论。胡克在他的《显微图集》一，叙述一种类似牛顿所做的三棱镜实验，他并未由此导出一系列颜色的理论，但他觉得牛顿没承认他的优先发现是一种轻视，于是加入学会会员中批评牛顿结论的行列。争论绵延3年。“在由于我的光学理论而起的讨论中……我被百般责难，”被批评得体无完肤的牛顿说，“以致我几乎要责怪自己轻率地抛弃静静追逐阴影的幸福。”他一度想“除了满足自己外，要绝对、永远地告别哲学”。
与胡克之间另一个纷争是关于光传播的介质问题。胡克采取惠更斯的理论，以为光在以太波上进行。牛顿认为这一理论无法说明光为何是依直线进行的。他代之提出一种微粒理论（Corpuscular Theory），即光是由一个发亮体散发出无数每秒以19万英里的速度直线前进的小颗粒而产生的。他驳斥以太为光的介质，却承认其为重力的介质。
牛顿将他讨论光的作品收入1704年的《光学》一。值得注意的是，此书用英文写成，写给“具有敏锐智慧、理解力，但对光学尚不熟悉的读者”。在书后他列举了31个问题，以备进一步讨论之用。第1个问题有先见之明地提出：“物体是否在某段距离外，作用于光，因这个作用而使光弯曲，这个作用是否在最近的地方最为强烈？”第30个问题说：“自然何不将物体变为光，将光变为物质？”
