谁能和她结婚而不引起外交风暴呢？若是西班牙人，则英、法会抗议，而新教苏格兰人会愤怒；若是法国人，则英格兰会反对，甚至以战争来阻止法苏联盟的重新复活；至于奥地利人查理大公，诺克斯早已在讲坛上大发雷霆，愤慨地反对与一个天主教徒结合，而伊丽莎白也告诉玛丽，与哈布斯堡皇族的婚事是一种敌意行为。
在一阵情意冲动下，玛丽斩断外交上的死结。兰诺克斯（Lennox）伯爵马修·斯图亚特（Matthew Stuart）本自认是继玛丽承继苏格兰王位的人，因为支持亨利八世对抗苏格兰而失去他的财产和地位，同时逃至英格兰以避开苏格兰人的报复。他想现在（1564年10月）是回去的好时机。不久，他19岁的儿子达恩里爵士（Lord Darnley），亨利·斯图亚特也回来了。由于他母亲的关系（同玛丽一样），他也是英格兰亨利七世的后裔。玛丽深爱这位嘴上无毛的年轻小伙子，她羡仰他的网球与琵琶技巧，她原谅他的浮华习气，认为是美貌造成，在她未识破他毫无诚意前，即与他坠入爱河。1565年7月29日，在伊丽莎白的抗议和她的枢密院半数表示不赞成的情况下，玛丽和这位少年成婚，并封他为王。莫雷于是退出枢密院，加入这位刚愎自用的女王的敌对阵营。
她享受了几个月带着麻烦的幸福时光。4年的孀居日子，已激起她对爱的渴望，而这股欲愿得偿真是莫大的快乐。她慷慨地付出她的爱，不惜赠予她丈夫一切。伊丽莎白的大使托马斯·伦道夫曾如此报告：“所有她能给予她丈夫的尊荣都已给予了，除了她丈夫使她满意外，没有人能令她高兴……她把她整个意志都献给了他。”好运改变了这位少年的心态，他变得独断异常、蛮横无理，他要求只有他与女王有治理国家的权力。他狂欢纵饮无度，冷落枢密院，不时地嫉妒与猜疑玛丽与大卫·里齐奥（David Riio）有暧昧关系。
里齐奥何许人也？他本为意大利籍的音乐家，1561年28岁时，他乘萨伏伊（Savoy）大使之车来到苏格兰。深好音乐的女王提拔他为音乐活动的负责人，她欣赏他的机灵、敏捷的智力及他具有的多彩多姿的欧陆文化。由于他熟谙法文与拉丁文，而且写得一手好意大利文，玛丽又用他为秘书。不久，她又让他草拟和撰写她的国外通信。他成为顾问，一位掌权者。参与决策，与女王共餐，有时与她静坐至深夜。苏格兰贵族发现他们被取代，又怀疑里齐奥替天主教会服务，因此图谋排挤他。
最初，达恩里本人也被奸巧的意大利人迷惑，他们同游共寝。里齐奥的职权与地位大增后，达恩里的平庸便使他在政治上被架空，加之女王对这位由仆从而大臣的深爱情感，更增加了达恩里的恨意。玛丽怀有身孕时，达恩里怀疑是里齐奥之子。伦道夫大使也相信。后来，亨利·果特（Henri Quatre）讥讽英格兰的詹姆士一世必是“当今的所罗门”，因为他的父亲是演奏竖琴的大卫。达恩里喝过威士忌之后，勇气遂增，于是参加摩顿伯爵（Earl of Morton）、巴顿·罗斯文（Baron Ruthven）男爵和其他贵族行刺里齐奥的阴谋。他们签了“约”，保证他们支持苏格兰的新教徒，并给予达恩里“亲王之权”、苏格兰王同具实权及玛丽死后的王位继承权。达恩里保证签约者免于“任何罪名”的后果，而且恢复莫雷与其他被逐贵族的地位。
1566年3月6日，伦道夫向塞西尔透露这个阴谋。3月9日，阴谋展开。达恩里进入闺房，玛丽、里齐奥和阿及尔（Argyll）正在那里进餐。他拧住女王，摩顿、罗斯文和其他人冲入，在玛丽无力的反抗声中将里齐奥逮出房间，刺杀于楼梯旁，总共有致命的56处刀伤。这时有人拉了警铃，一大群武装的市民向宫中进发，提议要把玛丽碎尸万段，但达恩里劝服他们离去。是夜和次日，玛丽留在霍利伍德宫中，成为谋杀团的俘虏。玛丽利用了达恩里的恐惧与爱情，因此他帮助她并伴随她于次夜逃脱至丹巴（Dunbar）。她在那里发誓要报复，请求所有王室支持者保卫她。或许为了分化敌人，她也召莫雷回枢密院。
保护她最得力的是第四代博斯威尔伯爵（Earl of Bothwell）詹姆士·赫伯恩（James Hepburn），一个奇怪而注定失败的人物。长得并不潇洒，但身体强壮，热情而有意志力，在陆上海上都堪称冒险家，精于刺术。他那种冷峻无畏的眼神令男人震慑，而他的言谈、粗线条作风、善诱女人的声名，也颇能吸引女人。他也是一个受过高等教育的人，一位作家及热爱书籍的人，当时无数的苏格兰贵族甚至无法书写自己的名字。女王本来讨厌他，因为他说女王坏话，但这也是赢得女人好奇心的一种手段。后来，女王见他具有勇猛好战的气质，便推举他为英格兰和苏格兰边区的代理指挥官；又据闻他熟谙船舰，便命他为海军部长；在获知他对珍·戈登（Jane Gordon）小姐有意时，她又促成这一桩婚事。
现在，因畏惧里齐奥的谋害者，并怀疑其丈夫和他们共谋，她转而向博斯威尔求助。她不是很快就喜欢上他，但他那种极端勇猛、精力充沛、充满信心的男性气质，正是深具女性特质的她一向渴求的，而且是弗朗索瓦二世或达恩里身上所未有的。她对其剑道无比尊敬，他的军队将叛者驱走或降服。不久，她就安安全全地回到霍利伍德宫了。虽然诺克斯赞成谋杀里齐奥，玛丽却以改善其生活费用的决定，暂时平息、安抚牧师们的不满。苏格兰平民从未喜欢过他们的贵族，都同情她，而有几个月，她深得众望。法国大使如此写道：“我从未见过女王如此被喜欢、被看重、被尊以荣耀，及她的臣民如此和谐。”她快分娩时，她愈加不安，因她怀疑在她无助的情况下，可能会被杀或被罢黜。她安全地产下一名男婴时（1566年6月19日），苏格兰举国欢腾，好像预见到这个孩子会成为苏格兰与英格兰之王。玛丽这时正居生命中的最高点。
但她和达恩里过得很惨。他抱怨她再度信任莫雷及她逐渐倾慕博斯威尔。曾有谣传说博斯威尔会绑架王室的婴孩，而以他的名义来治理国家。达恩里控告贵族杀害里齐奥，而自认无辜。贵族为了报复，向女王提供他参与阴谋的证据。阿及尔、列兴敦和博斯威尔皆建议女王应和他离婚，但她反对，以为这有害于王位继承。列兴敦答复说他们会寻求某些方法使她脱离达恩里而不伤害她儿子，她不赞成。她提议她宁愿退隐而由达恩里治国，而且提出警告来结束这次会晤：“我要你们不要做出任何使我的荣誉与良心沾上污点的事情，因此，我恳求你们，任事情照原状发展，直到上帝来解决为止。”至此她已好几次提及自杀之事了。
约1566年10月，阿及尔、詹姆士·巴富尔（James Balfour）爵士、博斯威尔及也许是列兴敦3人商定，决定除去达恩里。达恩里之父闻及风声，警告他的儿子。达恩里已和玛丽分居，现在前往格拉斯哥其父处（1566年12月）。他病倒在那里，虽然谣传他因毒药而病，实际是由于天花的缘故。这时，玛丽和博斯威尔逐渐亲近，令人怀疑他们之间有过奸情。诺克斯公开称她为妓女。她似乎曾要汉密尔顿大主教安排博斯威尔和他妻子的离婚。她提议去拜访达恩里，而他给她一封侮辱的回信，但她仍然去了（1567年1月22日）。她坚决地证实她的忠贞，再度唤起旧日的爱情。她求他回爱丁堡，保证她在那里照护他，使他恢复健康和快乐。
“宝盒信笺”（Casket Letters）此时上场了。这些信件据说是放在玛丽送给博斯威尔的银盒子中，1567年6月20日被欲图推翻女王的贵族的侦探从博斯威尔的一位仆人处取得。次日，宝盒由摩顿、列兴敦和其他枢密院要员打开，其内容不久之后送到苏格兰议会展露，后又送至1568年审判玛丽的英格兰委员会。其中有8封信和一些片断的诗，全是法文，没有署名和日期，但被认为是玛丽送给博斯威尔的。枢密院的贵族向苏格兰议会保证这些信是真实而未被篡改过的，玛丽则坚称其为伪造。其子显然认为是真的，因此将其销毁，现在只有复制本留传下来。欧陆君王们看过复本后，都相信是真的。伊丽莎白最先存疑，但还是怀疑地接受了其真实性。阅读它时，我们第一个反应必定是怀疑，一位图谋杀害丈夫的女人是否会如此大意并过分地在信上表示其意，而将它交给可能被截获或可能被收买的信差。信中如此诬蔑博斯威尔，而他还将之保存，似乎更显得不太可能。但在苏格兰更不可能有人，甚至包括精明的列兴敦（他相当受到怀疑）在内，能在获得宝盒与展示书信于枢密院或议会的一天之内，伪造具有如此分量的信。最热烈的一封——第二封——出奇的长，印刷时大概多达10页。若其为假，则这真是相当高明可赞的伪造术，因为其深具情感的内容太合乎玛丽的个性了，正如其笔迹也完全与她的相吻合。这显示出玛丽在谋杀达恩里预谋中是一位怜悯的、犹疑不决的及羞耻的共犯。
有病在身而心怀畏惧，又不得不信赖他人的达恩里，接受建议回到爱丁堡，他被安置在市郊古老的教会牧师公馆。玛丽解释说为避免其子遭感染，她不能立刻带他回霍利伍德宫。他在那里过了两周，玛丽每天去看他，照顾得如此勤奋与周到，他恢复健康，便写信给他父亲（1567年2月7日）：“……我很快恢复健康……是得自女王妥善的照顾。女王，我保证她确是如此，而她正如同一位自然又可爱的妻子。我希望上帝会照亮我们的心，让这久受痛苦煎熬的心愉快。”假如她知道他将被杀，则何以浪费烦而无聊的几周时间来照顾他，这实在是玛丽·斯图亚特之谜的另一部分。2月9日夜，她让他参加她的一个女仆在霍利伍德宫的婚礼。是夜，教区广场房子发生一起爆炸案，次晨达恩里被发现死在花园里。
玛丽最初表现得像是无辜的妇人，她悲恸、哀伤，发誓要报仇。她将房间漆成黑色，让窗帘深垂不见阳光，而独自待在黑暗中。她命令司法侦查，而宣布以土地与金钱重赏提供凶嫌的情报。市区墙上出现许多标语，控告博斯威尔谋杀，其中有一些影射这是女王所为，因此有公告要控者前来提出证据，并保证其安全且兑付赏金。标语的书写者拒绝露面，但兰诺克斯伯爵促请女王立刻捉拿博斯威尔来审判，博斯威尔对此表示同意。4月12日他受审。兰诺克斯或是因无实据，或是恐惧博斯威尔在京城的军队，选择留在格拉斯哥，并未到场。博斯威尔被判无罪，议会正式宣布他无辜。4月19日，他劝阿及尔、亨特里（Huntly）、摩顿及其他12位贵族，签《恩斯里之约》（Ainslee’s Band），表示他们相信他的无辜，保证护卫他，并赞同他和玛丽的婚姻。现在，女王公开赞扬博斯威尔，赠送给他贵重的礼物。
4月23日，她去斯特林探望她的儿子，此后她注定永不能再见到他了。在回爱丁堡途中，她和列兴敦被博斯威尔及其兵士拦截，被强解到丹巴（4月24日）。列兴敦抗议，博斯威尔以死来威胁他。玛丽搭救他，列兴敦获释。从此，他加入女王的敌阵。在丹巴，博斯威尔离婚的谈判复起；5月3日，他和玛丽回到爱丁堡，她宣布她已不受羁束；5月7日，他获准离婚；15日，她的天主教神父拒绝为他们主持婚礼，天主教前奥克尼（Orkney）的主教依新教仪式为他们举行婚礼。以前挚爱玛丽的欧陆天主教国家，现在都反过来认为她已堕落。苏格兰天主教士也不理会她，新教牧师要求她下野，民众敌视她，只有少数一些同情者将她那种鲁莽不顾后果的迷恋，归罪于博斯威尔给她的一剂爱之药。
6月10日，一伙武装群众包围了玛丽和博斯威尔所居的博思威克（Borthwick）城堡。他们逃走了，玛丽女扮男装。在丹巴，博斯威尔召集1000人，借此，他和玛丽企图打回爱丁堡。他们被一支兵力相当的队伍挡在卡伯里山（Carberry）附近（6月15日），这支队伍所举的旗上，画的是已故达恩里和其子詹姆士六世的像。博斯威尔提议以个人决斗来解决问题，玛丽不准。她同意屈服，但要以博斯威尔能逃走为条件。之后，她又要求，若她和平地加入他们，叛军领袖保证效忠于她。博斯威尔逃到海岸，前往丹麦，以后一直为丹麦王所禁，10年后去世，是年42岁（1578年）。
玛丽回到爱丁堡，途中军民喧叫“烧死这位妓女！烧死她！”、“杀死她！”、“溺死她！”她被安顿在门禁森严的市长官邸中，衣衫不整，蓬头垢面。在其窗下，群众不断地以粗劣的话来威吓她。6月17日，在其强烈抗议下，她被移到离首都北方30英里的利芬湖（Leven）上偏僻而安全的小岛监禁。据其秘书克劳德（Claude Nau）的报告，她在那里生下一对早产的双胞胎。她修书陈情法国政府，法国拒绝干涉。伊丽莎白令其公使保证玛丽安全，并以重刑威吓贵族不得伤害女王。诺克斯要求处决玛丽，并预言若宽宥玛丽，上帝会降一场大瘟疫来惩罚苏格兰。6月20日，贵族得到宝盒信笺，她要求议会准予申诉，但议会以信笺已足以处置她的案件为由拒绝。7月24日，她签字退位，莫雷代其子摄政。
她在利芬湖城堡当了11个月的俘虏。对她严苛的监禁逐渐松懈下来，她与堡主威廉·道格拉斯（William Douglas）一家共餐。堡主之弟乔治迷恋她，助她逃亡（1568年3月25日），但被俘回。5月2日，她再度逃亡成功。在年轻的道格拉斯的保护下，她逃抵外界大陆，遇到一群天主教徒，乘夜赶往福斯湾，渡过福斯湾后，在汉密尔顿家中受到庇护。5天内，6000人马聚集，发誓为她恢复王位。但莫雷号召苏格兰新教徒武装起来，在格拉斯哥附近的兰恩塞德（Langside），两军相遇（5月13日），玛丽纪律不佳的军队被克，她再度逃亡，一连三夜赶至索尔威湾（Solway Firth）上的邓德雷南（Dundrennan）修道院。这时，她将一粒钻石还给赠送者，这是以前伊丽莎白送给“她最亲爱的妹妹的”。她同时附上一言：“我将这颗珠宝送回女王，这是她应允的友谊与助益的象征。”1568年5月16日，她乘一艘未遮盖的渔船，渡过索尔威湾，进入英格兰，将其命运交给她的劲敌。
