目前只有一种势力能够与查理在西班牙颉颃——教会。查理是亲天主教的，不过他反对教皇。与斐迪南一样，他寻求将西班牙的天主教教会完全脱离教皇管辖的方法。直到目前来说，他的这项措施是成功的，在他治理西班牙期间，教会圣职的任命和税收完全在他控制之下，并运用教会的势力和经济来推进政府的政策。在西班牙，与在法国一样，宗教改革无须将教会隶属国家之下。但在他统治的时代，他有一半时间消耗在自己统领的王国内，这一期间他非常热心于信奉西班牙的正教，以致在晚年（除哈布斯堡王朝的权力外），似乎没有比压制异端更重要的事了。教皇打算让宗教裁判所的工作采取温和政策时，查理一直支持这项工作，直到他去世。他深信异端是导致尼德兰混乱和内战的原因，所以下决心用计谋阻止其在西班牙发展。
在查理的治理下，西班牙的宗教裁判所疯狂的迫害转趋和缓，但它的司法权扩大了。它担任文字检查，有权搜查每家书店，下令焚毁有异端嫌疑的书籍。它有权调查和惩罚性变态的行为。它还制定一种称为纯粹血统的法规（rules of limpieza），凡改变正统宗教信仰及受裁判所惩罚过的人，他们的后代都没有升入高贵阶级和出人头地的机会。他们用严厉的眼光来看神秘主义者，因为其中有些人称他们直接与神交感，所以无须参加教会。异教徒裁判所对所谓开明派（Alumbrados）的人采取宽大的态度，倒是对西班牙的新教徒始终采取严厉的措施。
和在北欧一样，一位伊拉斯谟派的信徒在新教的战斗中，率先发力。少数公正的教会人士，对人道主义者谴责教士们的罪过，大为赞扬。其实，在查理来到西班牙以前，辛曼尼斯和其他一些人已经把教会中可以看得到的弊端加以改革了。路德主义之所以能渗入西班牙，或许是由王室侍从人员之中的德国人和佛兰德斯人带进来的。有一名德国人于1524年在巴伦西亚，被宗教裁判所以供认同情路德而判罪。另外一位佛兰德斯的画家于1528年因为对炼狱和赎罪券持有异议而被判无期徒刑。弗朗西斯科·圣罗曼（Francisco de San Roman）是我们知道的第一位西班牙路德派的信徒，他在1542年被判火刑而死，当时一群狂热的旁观者竟有用刀刺他的。
昆卡的胡安·蒂亚兹（Juan díaz）曾在日内瓦吸收了加尔文的思想。他的兄弟阿方索从意大利匆忙赶回西班牙，劝服他重新皈依正统宗教，可是失败了，阿方索赶回时他的兄弟已经被杀（1546年）。在塞维尔，有一位在大教堂研究经典的教士，名叫胡安·吉尔（Juan Gil）或埃吉迪奥（Egidio），被判一年监禁，理由是他传扬反对敬拜雕像和向圣徒祷告，并反对因善行功劳可获拯救的道理。在他死后，还有人将他的骸骨从土中掘出来加以焚烧。他的同伙教士康斯坦丁·彭斯（Constantino Ponce de la Fuente）继承他的宣传工作，因而死在宗教裁判所的地牢之内，康斯坦丁的14名同伙被烧死，其中包括4名修道士和3名妇女；还有大部分人被判处不同的刑罚；他们聚会的房子也被夷为平地。
在巴利阿多利德，还有半新教（semi-Proatestant）团体的发展，其中包括具有影响力的贵族和高级教士。他们背叛宗教裁判所，差不多所有人都被拘捕和判罪，其中有些人打算离开西班牙，结果被抓到送回来。查理五世那时退休在尤斯特（Yuste），他建议对这些人不必施以怜悯，悔改的人砍头，不悔改的人就用火烧死。在1559年5月21日的“三位一体节”（Trinity Sunday）中，有14名新教徒在欢呼的群众面前，被判执行死刑，除其中一人声明撤回他以前的信仰，其余的人统统宽减为斩首；不悔悟的安东尼奥被活活烧死，他23岁的妻子莱昂诺尔·西内洛丝承认悔改，减刑为无期徒刑。经过十年的监禁生活后，她撤回以前的悔改声明，宣布她的异端信仰，并要求像她丈夫一样地活活烧死，她的要求被批准。1559年10月8日，由菲利普二世亲自主持异教徒裁判所的宣判，将26名以上的被告，在20万人面前示众。两人被判活活烧死，10人被绞死。
在此时期，宗教裁判所逮捕的受害者中，最著名的是托莱多的大主教巴托罗梅·卡兰萨（Bartolomé de Carranza），他也是西班牙的首席大主教。他为多米尼克派修士时，是一个活跃的人物，多年来从事搜捕异端的工作。查理曾任命他为出席特伦特会议的特使，并派遣他代表查理出使英国，参加菲利普与玛丽女王的结婚大典。他被选任大主教时（1557年），除他自己外，一致选举他。但有些“新教徒”在巴利阿多利德被捕时，就供出卡兰萨曾秘密地对他们表示，同情他们的意见。同时，他被发现曾与西班牙籍的意大利宗教改革家胡安·巴尔德斯（Juan de Valdés）有书信往来。当时有影响力的神学家梅尔策·卡诺（Melchior Cano）也控告他赞成路德的因信称义的教义。他被逮捕，距离他被升为西班牙最高教会职位只有两年时间：由这件事我们可以判断当时西班牙宗教裁判所的权力是何等之大。他被关在一座监狱中达17年之久，其时在托莱多和罗马，当局正对他的生活和著作加以详审。教皇格列高利十三世宣布他对异端邪说有“热心的嫌疑”，下令他发誓16项主张，并予停职5年的处分。卡兰萨谦卑地接受这项判决，尽力实行指定给他的惩罚；但是在5周之内，他竟因受监禁和屈辱，损耗健康过度后去世了（1576年）。
新教教义在西班牙的一切危机，也随着他一起结束。1551年至1600年，因新教异端邪说的罪名被执行死刑者约200人——平均每年4人。老百姓很多世纪以来怀恨莫尔人和犹太人的心理，造成他们固定于信奉那不可动摇的正统宗教的气质；天主教教义和爱国主义结为一体；宗教裁判所发现，要扑灭具有独立思想的西班牙事变是一件简单的事，只须经历一代或两代的时间。
