当他想重新开始他曾在大约17年前折断的生命之索时，他已经48岁了。他变了，佛罗伦萨也变了。佛罗伦萨在他不在的岁月里变成了一个半民主、半清教徒的共和国，他却仍然习惯于公爵的统治和舒适贵族化的奢侈与生活方式。佛罗伦萨人经常批评他的丝绒、他和蔼的举止和他那些鬈发的年轻家仆。比他小22岁的米开朗基罗憎恨跟他自己那破鼻子成明显对比的那些姣好面孔，屡屡陷入贫困的他怀疑达·芬奇是从何处得到这么多钱过如此富裕的生活。达·芬奇在米兰的日子里曾积攒下约600多个金币。现在他拒绝任何委托，甚至曼图亚那专横的马尔凯斯也请不动他，而且当他工作时他仍然带着过去惯常的闲散慵逸。
托钵苦行派的修道士们曾请小利比为他们的阿努西亚塔教堂画一个祭坛。达·芬奇偶尔表示他想做类似的工作。小利比很礼貌地把这件差事交给这位被公认为欧洲最伟大的画家。苦行修道士们让达·芬奇和他的“家眷”住在修道院里，而且似乎支付他们一大笔费用。1501年的某一天，他揭开计划要画的《圣母、圣子、圣安妮与圣约翰》（The Virgin and Child with St.Anne and the Infant St.John）一画的稿图。它“不仅让每一个艺术家惊奇”，瓦萨里说，“而且当它展示出来……男女老幼在两天时间里拥去观赏，宛如喜庆节日一样，令他们感到非常惊异”。我们不知道这幅现存于伦敦柏林敦宫（Burlington House）中属于皇家艺术学院珍藏的画是否与真人一般大小，虽然法国权威人士们愿意相信它是相当不同于存在卢浮宫里的画的第一幅。轻带骄傲的微笑使画稿中圣母的面孔更温柔更愉快，这是达·芬奇的一个奇迹。与它相比，蒙娜丽莎的微笑是粗俗的、冷嘲的。然而，虽说它仍是列在文艺复兴最伟大的绘画中，但它是失败的。圣子并不平稳地坐跨在母亲张开的两腿之间，显得有些不雅，韵味不佳。很显然，达·芬奇没有为苦行修道士把这个草稿变成一幅画，他们必须请小利比，后又请佩鲁吉诺来画祭坛。但是不久之后——也许不同于那幅存于柏林敦宫的画稿——达·芬奇绘了那幅现存于卢浮宫的《圣母、圣安妮和耶稣》（The Virgin，St.Anne and the Infant Jesus），从安妮加冠的头到圣母的脚——令人反感地赤裸着，却非凡的美好——这是一次技术上的胜利。在长方形的构图里那些曾在画稿中失败的，在这里却完全成功了。圣安妮、圣母、孩子和羔羊的四个头画出了一个完好的结构：小孩和他的祖母正专注在圣母身上，以这些女人举世无双的衣饰填满了发散的空间。达·芬奇特殊的障眼手法使所有轮廓变得缓和，有如模糊的影像使他们的生命变得温柔。达·芬奇风格的微笑——在画稿中的圣母上或在绘画中的安妮上——创立了一个由达·芬奇的崇拜者继续了半个世纪的风尚。
从这些对微微召唤不可思议的着迷到替恺撒·博尔贾当军事工程师（1502年6月），达·芬奇经过一段几乎令人难以置信的转变。博尔贾崛起于罗马纳他的第三次战役中，他要一个能制地形图、装建堡垒、桥梁或者导引河流及能发明攻防武器的人。也许他曾经听过达·芬奇说出或绘出新的战争机械的想法。例如他为一辆装甲车或坦克做的草稿，车的轮子是由它挡板里面的军士来移动的。达·芬奇曾写道：“这些车子代替了象……它能由兵士举枪刺戮，能由兵士持风箱发出吼声惊吓敌人的马匹，它可以带着配枪的兵士打垮每一个连队。”“或者，”达·芬奇说，“你可以在战车的侧腰上装上可怕的大镰刀，而且可以在向前突出的车辕上装上更能致命的回转镰刀。这些砍人将像在田里割草一般。或者你可以使战车的轮子转动一个机械装置，那将使车轮旋转时在四个方面致命地打击敌人。你可以让兵士借着保护的掩盔攻击一个碉堡，而且你可以借着掷进有毒瓦斯的瓶子驱散被围者。”达·芬奇曾计划写一本“如何利用放水造成狂暴的水灾以逐退军队”的书和一本“如何借着关闭留经峡谷流水的出路淹没军队”的书。他曾经设计一些机器，如能从一个回转的平台上自动地发射一连串箭枝的设计，如能在车架上举起炮来的装置，如在一支围攻的兵力试图攀登城墙时拥挤的梯子能向前倾的装置。恺撒·博尔贾把大部分这些新奇的机器当成不能实用的东西搁置起来。他在1503年围攻塞里（Ceri）城时试用过一两样。虽然如此，他还是发布权威的特许状（1502年8月）：
致所有我们的副官、城主、队长、雇佣兵队长、官员、兵士及百姓：
我们强迫和命令对此状持有者，即我们最优秀及备受敬爱的仆人、建筑师和总工程师达·芬奇——我们任命此人彻底检视在我们领土上的要塞和碉堡，依照它们的需要和他的咨议，我们可以提供必需品——给予完全免除通行税及租税、对他本人及其友人致友善的欢迎，完全如他所愿地自由去观看、检查或做准确的实验，而且为了这个任务如他所需地给予人力协助，及所有可能的支援和帮助。我们的意旨要求在我境内主持任何工作的每个工程师必与他商议并遵照他的指示。
达·芬奇的著作很多，但很少有关于他自己的。我们会喜爱他对博尔贾的意见，而且也可以拿他对佛罗伦萨在这时出使博尔贾的特使——马基雅维利的看法相比。但是我们所知道的是，达·芬奇曾访游过伊摩拉、法恩扎、弗利、拉韦纳、里米尼、佩萨罗、乌尔比诺、佩鲁贾、锡耶纳及其他城市。当博尔贾在那儿设陷及绞杀四个背叛的队长时，他正在圣尼加利亚，而且他献给博尔贾意大利中心地区6幅详明地图，其中显示河流方向、地势的轮廓和特性，河流、山岳、碉堡和市镇间的距离。随后不久他知道博尔贾已死在罗马，博尔贾帝国正在崩溃，同时博尔贾的敌人登上了罗马教皇的王位。达·芬奇活动的新世界在他面前凋落，他再次回到佛罗伦萨（1503年4月）。
这年10月，彼得罗·索德里尼——佛罗伦萨政府的首脑——提议达·芬奇和米开朗基罗，每人为维奇奥宫新建的五百人厅（Hall of the Five Hundred）各作一幅壁画。两人都接受了，订定了严格的契约，两位艺术家各回他们的画室设计草稿。每人画些佛罗伦萨军队的胜利场面。米开朗基罗画对比萨之战，达·芬奇画佛罗伦萨军在安吉亚里大胜米兰军之役。一些机敏的市民随着作品的进度把这当作一项罗马斗士般的竞赛，在双方的优点和风格上兴奋地争论，而且有些旁观者认为任何一幅画绝对地优于另一幅，都会决定以后的画家到底跟随达·芬奇对纤细微妙感情的喜好，或者跟随米开朗基罗对有力肌肉和有魔力的力量的偏好。
也许就在那时，米开朗基罗，这位年轻的艺术家由他原来对达·芬奇的厌恶变成了穷凶极恶的侮辱。有一天，在圣特里尼塔广场，一些佛罗伦萨人正在讨论《神曲》里的一行诗，看见达·芬奇经过，他们拦住他，要求他解释。就在那时，米开朗基罗也出现了，他热衷于研究但丁是众所周知的。达·芬奇说：“米开朗基罗在这里，他会解说这节诗。”这位不高兴的“泰坦”（Titan）以为达·芬奇开他玩笑，非常轻视地开始说：“你自己解说！你就是那个做了个马模型去铸铜而没铸就让它没完成的人，可耻！而那些米兰阉鸡们还以为你能完成它呢！”我们听说，达·芬奇深深地吓了一跳，但没有回答，米开朗基罗则继续生他的气。
达·芬奇很谨慎地准备他的稿图。他参观在安吉亚里交战地点的景色，读有关它的报告，制作了无数战争的愤怒或死亡的痛苦中有关人和马的素描。他发现虽然过去在米兰很少，现在却有一个把动作放进他的艺术品中的机会。他完全利用上了，而且描写生死冲突如此激烈，可以看到佛罗伦萨几乎在颤抖。没有一个人会想到这位佛罗伦萨最精练的艺术家能够想象或画出这么一幕爱国战争的景象。也许达·芬奇运用了他过去在博尔贾军队中的经验，那些他可能曾经目睹到的恐惧能够在他的画里表达出来，并从他心里祛除。约1505年2月，他完成了他的稿图，同时开始在西奇辛托（Sala dei Cinquecento）大厅画它的中央部分——斯坦德之役（The Battle of the Standard）。
曾经研究过物理学和化学而不曾知道《最后的晚餐》的命运的他，现在又犯了一次悲惨的错误。因为做过用热力固着色彩的试验，他想借着地板上火盆的热力把色彩固着在灰泥墙上。房间是潮湿的，冬天时很冷，热力传达不到上面的部分，灰泥不能吸收色彩，上面的颜色开始退落，而任何疯狂的努力也不能修复这些损坏。同时，财政的困难发生了。贵族院每个月只付达·芬奇15个金币，这完全不能与在米兰洛多维科聘他时给付160个左右金币的数目相比。当一个不机警的官员用铜币付他月薪时，达·芬奇拒绝接受。他在羞辱和失望中放弃这桩事业，而仅仅在米开朗基罗的一件事上得到稍稍的安慰，那就是米开朗基罗在完成他的稿图之后，竟然没有在那儿绘上一笔，就接受了教皇尤利乌斯二世（JuliusⅡ）的召请去罗马工作了。
1503年至1506年，达·芬奇断断续续地绘了《蒙娜丽莎》的肖像。《蒙娜丽莎》就是伊丽莎贝塔（Madonna Elisabetta），弗朗西斯科（Francesco del Giocondo）的第三个妻子，他在1512年成为贵族院的一分子。或许弗朗西斯科在1499年埋葬的孩子是伊丽莎贝塔的孩子中的一个，而这次丧子可能有助于塑造在伊丽莎贝塔的微笑后面严肃的表情。在这3年里，达·芬奇一定召她到他的画室很多次，他一定在她的绘像上耗费了所有他技术上的秘密和色彩上细密的差异——以明暗柔和来塑造她，在一个想象的水天和山树的背景下来框衬她——给她穿上织成折纹用绒缎做成的衣服，它的每一个褶折都是一个杰作——热衷而谨慎地研究使嘴巴移动或成形的微妙肌肉——带来了乐师为她演奏，促使她的表情显出了一位母亲从对失去小孩的怀念中醒悟过来的慈祥。这些令人微微感觉到，在画里达·芬奇达成了使哲学和绘画融和的精神。一千次的停顿，一百个分心的兴趣，与“安吉亚里之役”一画同样的努力，所留下来的是他的观念中未曾破损的整体和对他热衷的事物非同寻常的执拗。
不久之后，就是这张脸使成千上万的纸张投向油墨之海。这不是一张非常可爱的脸，有着一个略短的鼻子，和很多油画和大理石上的少女——如在任何柯勒乔的画上——相比，“丽莎”并不过分美好；而是她的微笑——在双眼中一道初生的闪光，她在双唇上的一道愉快、抑制而微微上扬的曲线——使她能幸运地流传很多世纪。她对什么发笑？是乐师的努力使她高兴？或是笑一个画了1000多天而还没完的艺术家那份不匆忙的勤勉？或者那不只是蒙娜丽莎的微笑，而是女人，所有的女人，对男人说：“可怜热情的爱人！一股自然的控制力量继续不断地用你们对我们肉体荒诞地渴求来燃烧你们的神经，用一个对我们的魅力加以相当不可理喻地理想化来软化你们的头脑，促使你高唱抒情诗却用成就来抑消你们的快乐——而所有的一切可能使你们被掷进为人父亲的状态！还有比这些更荒谬的事吗！但是我们都一样被诱谄了，我们女人比你们为你们的迷恋付出更重的代价。现在，可爱的傻瓜！我们所要的只是快乐，而当我们被爱时，生活得到了补偿。”或者蒙娜丽莎带有的就仅仅是达·芬奇他自己的微笑——笑他内向的性格几乎没有勇气去轻轻地触摸一个女人的心，而除了在男人的遗忘中使小小名声微微地动摇之外，可以相信自己已经没有天才或恋爱的命运了？
当画完最后的背景时，达·芬奇留住这张画，声称这张在一般画像来讲已算完成的画还不够完整。也许这位丈夫不喜欢看到他妻子从墙上时时向他或他的宾客卷起双唇。很多年后弗兰茨一世花了4000克朗买下它，框置在他枫丹白露的宫殿里。由于日推月移，它的精微部分显得模糊，它存挂在卢浮宫高贵的卡洛厅（Salon Carré）里以娱每天成千的膜拜者，并等待着时间冲淡或加深蒙娜丽莎的微笑。
