当腓特烈在福查的统治不断发展时，其长远的目标越来越明显，即在整个意大利确立其统治，统一意大利与日耳曼，恢复旧日的罗马帝国，可能再度使罗马成为西方世界的政教首都。1226年，他邀请意大利的贵族和各城邦在克雷莫纳召开联邦议会。他接着邀请了斯帕拉托公国和教皇国，并且使他的军队通过教皇的领土而表明了他的意图。教皇禁止斯帕拉托的贵族们前往参加会议。伦巴底各城市怀疑腓特烈要将帝国对他们名义上的统治变为实际上的统治，也拒绝派遣代表，而组织第二个伦巴底联盟，包括米兰、都灵、布雷西亚、曼图亚、博洛尼亚、维琴察、维罗纳、帕多瓦及特拉维索，成立25年的攻守同盟。帝国会议未能召开。
1234年，腓特烈的儿子亨利起而反抗其父，与伦巴底联盟联合。腓特烈自己由南意大利仅带足够的现金到沃姆斯去，未带任何军队，当听到他来到的消息，或收到他的金子后，叛军便瓦解崩溃。亨利被系囹圄达7年之久，当他被移到另一地方监禁时，他骑着马坠崖而死。腓特烈前往美因茨，并在那里主持联邦议会，说服许多与会贵族参加他的行列，以恢复帝国在伦巴底的权力。由于得到这一助力，他在科特努奥瓦击败伦巴底联盟的军队（1237年），除了米兰和布雷西亚外，所有的城市都投降了。教皇格列高利九世出面调停，但腓特烈统一的梦想无法与意大利人对自由的热爱相调和。
这时，格列高利虽已年届90岁且多病，但仍决定与伦巴底联盟共患难，而将整个教皇的世俗权力作为这次战争的赌注。他对伦巴底各城市并无偏好，也像腓特烈一样，认为他们的自由将导致混乱与不和，他也知道他们护庇公开反对教会的财富与世俗权力的异端分子。而在此刻，被围困的米兰城中，异端分子正亵渎祭坛，推倒十字架。但如果腓特烈征服了这些城市，教皇国将被一个在基督教及教会的敌人统治下的帝国吞噬。1238年，格列高利说服威尼斯与热那亚加入联盟，以对腓特烈作战。在一篇强有力的通谕中，教皇指控皇帝是无神论者、亵渎神、专制及企图摧毁教会权威。1239年，教皇将皇帝处以破门律，命令每一位罗马天主教高僧宣布他的不法，并解除其臣民对皇帝效忠的誓言。腓特烈在致欧洲各国国王的一封传阅信函中，驳斥其为无神论者的指控，并控告教皇企图摧毁帝国，而诱使所有国王向教皇国屈从。于是，帝国与教皇国最后一次斗争开始。
欧洲的国王们同情腓特烈，却甚少给予协助。日耳曼和意大利的贵族站在他那边，希望能使城邦恢复对封建地主的服从。在城市中，中下阶级大致站在教皇那边，旧日耳曼的保皇党和教皇党再度复现，甚至在罗马也有这种分裂，在那里有许多腓特烈的支持者。当他以恺撒第二的姿态，率一小股军队向罗马进发，沿途各城市一一开启城门投降。格列高利预知将被掳，领着一列哀伤的教士通过都城。老教皇的勇气与羸弱感动了罗马人的心，许多人拿起武器来保护他。为了避免正面的冲突，腓特烈绕过罗马，在福查过冬。
他说服日耳曼亲王们加冕他的儿子康拉德为罗马王（1237年），令他那能干但残忍的女婿罗曼诺（Eelino da Romano）统治维琴察、帕多瓦、特拉维索，而将其他归服的城市交给他最宠爱的儿子恩齐奥。恩齐奥“论面貌、体格，均是我们心目中的偶像”，俊美倨傲，欢愉，作战勇敢，诗文也有成就。1240年春，皇帝夺下拉韦纳和法恩扎（Faenza）两城；1241年，摧毁了本尼凡托，后者或为教皇国军队的集中地。他的舰队拦截了一支热那亚舰队，该舰队正护送一群法兰西、西班牙、意大利的大主教、主教、高僧和传教士到罗马。腓特烈将他们监禁在阿普利亚作为谈判的人质。他很快释放了法兰西人，但仍长期地拘留其余的人。他们有些死于狱中，而使惯于认为神职人员不可侵犯的欧洲震惊。其后有许多人相信腓特烈就是许多年前弗洛拉的术士约阿希姆所预言的“敌基督者”（Antichrist）。腓特烈提出，如果格列高利愿缔定和平条约，他就释放那些教士。但年老的教皇仍然坚持立场至死（1241年）。
英诺森四世容易妥协。在圣路易的怂恿下，他同意了和平的条件（1244年），但伦巴底各城拒绝批准该协定，并提醒英诺森，格列高利曾保证教皇国不单独媾和。英诺森秘密地离开罗马，逃到里昂。腓特烈再度燃起战火，至此似乎没有一支武力能阻止他征服兼并教皇国及在罗马确立其统治权。英诺森召集教会的高僧到里昂开会，会议重申将皇帝处以破门律，并称他对其宗主教皇是不道德、不虔敬、不忠诚的臣属（1245年）。在教皇的怂恿下，一群日耳曼贵族和主教选出亨利·拉斯佩来与皇帝对抗。亨利·拉斯佩死后，他们再选荷兰的威廉继承他。对所有支持腓特烈的人一律处以破门律，而对腓特烈效忠地区的教权一律停止；并以一支十字军征讨他和恩齐奥，而那些曾举十字标志解放巴勒斯坦的人，只要参加对抗这位不虔敬的皇帝，便能享受十字军的所有特权。
在一片怨恨与复仇声中，腓特烈索性采取破釜沉舟的政策，他发出一道《改革宣言》（“Reform Manifesto”），谴责教士“为世界所奴役，恣意放肆，不断地搜括财富，而其虔敬之心却逐渐消失”。在两西西里，他没收教会的财产来支持其战争。当阿普利亚某个市镇阴谋俘虏他时，他将叛党的领袖们弄瞎，切断手足，然后予以杀害。因收到其子康拉德的求援，他向日耳曼进发，在都灵得悉帕尔马城已推翻他的卫戍部队，恩齐奥陷于危险当中，而整个北意大利，甚至西西里，均已叛变。他逐城地平定叛乱，而从每一个城市带走人质，这些城市再叛变时，则将这些人质乱刀砍死。在犯人中若发现有教皇的信差，则砍掉他的手足。
在围攻帕尔马城期间，腓特烈对毫无进展颇不耐烦，便和恩齐奥及50名武士到附近的沼泽地带猎捕水鸟。当他们离开时，帕尔马的男男女女奋不顾身地突围而出，倾覆了群龙无首、毫无秩序的军队，并且掳获皇帝的财宝、嫔妃及巡回动物园。腓特烈加重征税，募集新军，重新奋斗。当他得悉自己所亲信的国务大臣皮埃罗·德勒·维格涅正阴谋背叛，腓特烈将他逮捕并弄瞎了他。皮埃罗用头撞击监狱的墙，至死方休（1249年）。同一年，消息传来，说恩齐奥在拉·福萨尔塔（La Fossalta）一役中为博洛尼亚人所掳。大约同时，腓特烈的医生企图毒杀他，在短短时间内，接连而至的这些打击，使腓特烈元气顿丧。他退隐到阿普利亚，不再参加战争。1250年，他的将军们赢得几场胜仗，整个情势似乎又有转变。圣路易在埃及被穆斯林所执，向教皇英诺森四世提出停战要求，以便使腓特烈能援助十字军。虽然希望复现，身体却已衰退了。“痢疾”，这个屡挫中古诸王锐气的司报应者，使这位高傲的皇帝病倒了。他要求赦罪，终获宽恕。这位自由思想者穿上僧侣的长袍，于1250年12月13日死于弗奥伦提诺。人们私下窃论，谓其灵魂被魔鬼带着，经过意大利北部埃特纳火山（Etna）坑，进入地狱。
他的影响力并不显著，其所建立的帝国很快崩溃了，紧跟着而来的是较他来时更大的混乱。他努力达成的统一消失了，日耳曼也分裂了。而意大利的城市追求自由与创造力，因为混乱，最后造成一个一个公爵及佣兵队长的专政，这些人几乎不知道何为自由，承袭了腓特烈败坏的德行、学术上的自由风气及对文学艺术的奖励。文艺复兴时代专制君主们刚健狂妄的才智表现，正是腓特烈个性与思想的反映，却没有他所具有的优雅与风度。在腓特烈的思想和宫廷里，古籍代替了《圣经》，理性代替了信仰，自然代替了上帝。在经过一段正统学说之后，它影响了文艺复兴时代的人文主义者和哲学家。腓特烈是文艺复兴时代前一世纪的“文艺复兴者”（Man of Renaissance）。马基雅维利的《君主论》（Prince）中，虽然一再提及恺撒·博尔贾（Caesar Borgia），但实际上是腓特烈预先促成其思想体系的成形。在尼采的心目中有俾斯麦和拿破仑，但他承认腓特烈的影响力，他称腓特烈为“据我的评断，欧洲第一等的人才”。其后代为其德行所震惊，为其心智所迷惑，不明底蕴地赞赏他伟大的帝国异象，一再引用马太巴利斯的话“世界上最奇妙的改造者及不世出的奇才”来形容他。
